fotometrické metody

Fotometrické metody

Vstupní předpoklady

  • Spektrum, rozklad světla
  • Intenzita světla
  • Koncentrace, výpočet, 
  • Kalibrační křivka

Princip metod

Absorpce části spektra

Při průchodu světla látkou, může docházet k pohlcení části světelného spektra. Absorpce je fyzikální proces, při kterém jsou fotony světla zachytávány látkou, například atomem. Energie zachyceného světla se přemění na energii kinetickou a na teplo nebo může být opět vyzářena (obvykle jako energie o větší vlnové délce – fluorescence). Míru absorpce vyjadřuje absorpční koeficient.

Barevnost látek

Absorpce v oblasti viditelného světla vede k barevnosti látek. Průhledná látka má barvu odpovídající záření, které sama neabsorbuje. Roztok barevné látky absorbuje barvu doplňkovou. (Modrý roztok absorbuje barvu žlutou, roztok fialový absorbuje barvu zelenou, červený azurovou, žlutý absorbuje barvu modrou.)

Přehled pozorovaných barev při absorpci ve viditelné oblasti

Pozorovaná barva Barva absorbovaného světla λmax absorbovaného světla [nm]
žlutozelená Fialová 100-435
žlutá Modrá 435-480
oranžová Zelenomodrá 480-490
červená Modrozelená 490-500
purpurová Zelená 500-560
fialová Žlutozelená 560-580
modrá Žlutá 580-595
zelenomodrá Oranžová 595-605
modrozelená Červená 605-700

Intenzita barvy pak závisí na míře světelné absorpce.

Transmitance

Pokud měříme intenzitu světla, můžeme zaznamenat pokles intenzity poté, co paprsek světla prošel vzorkem. Vzorkem může být nejčastěji roztok, ale i vrstva látky v podobě fólie, nátěru apod. Hodnotu poklesu intenzity vyjádříme zlomkem prošlého světla oproti světlu vstupujícímu. Výsledný podíl, se nazývá Transmitance a vyjadřuje se v procentech.

U čirých látek takový pokles nezaznamenáme. Některé čiré látky jsou však takto měřitelné v UV oblasti, kde vykazují absorpci (aromáty - benzen 254 nm).

Nejpřesněji můžeme hodnotu transmitance zjišťovat, měříme-li intenzitu světla v oblasti nejvyšší absorpce látky, nazývaném v Absorbční maximum.

Transmitance závisí na látce (molární extinkční koeficient ε), koncentraci a délce kyvety. Závislost transmitance na koncentraci  je exponenciální.

Absorbance (extinkce)

Absorbance je logaritmus transmitance. Jelikož závislost transmitance na koncentraci je exponenciální, je obtížné sestrojit kalibrační křivku pro vlastní měření. Proto je vhodné matematicky zlogaritmovat hodnoty transmitance, protože výsledná závislost bude lineární. Lineární závislost je pak velmi snadné převést do grafu, ať v počítači, nebo za použití tužky a milimetrového papíru. Závislost absorbance na koncentraci, délce kyvety a molárním extinkčním koeficientu látky, se nazývá Lambert-Beerův zákon.

A = -log Ip/Io = e.l.c

Vliv koncentrace na přesnost měření. S rostoucí koncentrací klesá přesnost a správnost měření. Při měření se snažíme naředit vzorky tak, aby jejich absorbance měly hodnoty v intervalu od 0 do 1 (transmitance 10%). V této oblasti je  Závislost absorbance na koncentraci lineární.

Nepřesnosti měření vznikají novými interakcemi v málo zředěných roztocích, a také nižší citlivostí měřících senzorů při značném poklesu intenzity světla.

Lambert- Beerův zákon

Zákon světelné absorbce. Při průchodu paprsku světla prostředím, které je schopné absorbovat, dochází k poklesu jeho intenzity. Vstupující paprsek je intenzivnější, než paprsek vystupující. Jejich vzájemný poměr vyjádřený procenty se nazývá Transmitance a nabývá hodnot od 0 do 1.  Respektive 0-100%

Při konstantní tloušťce vrstvy a konstantní vlnové délce světla je Transmitance závislá na koncentraci.

Vztah pro transmitanci:

V praxi však při průchodu paprsku kyvetou dochází k reflexům na kyvetě a optických členech přístroje. Pro porovnání se tedy využívá slepého vzorku, který obsahuje veškeré součásti jako vzorek měřený, avšak bez stanovované látky.

  • T - transmitance
  • Iv - intenzita světelného toku procházejícího vzorkem
  • Is - intenzita světelného toku procházejícího slepým vzorkem
  • ε - molární absorpční (extinkční) koeficient
  • l - délka kyvety
  • c – koncentrace

Jak vidíme na vzorci, je závislost Transmitance na koncentraci exponenciální, což ztěžuje tvorbu kalibrační křivky a odečítání hodnot koncentrací. Proto se začal používat záporný dekadický logaritmus Transmitance, zvaný absorbance (A), dříve Extinkce (E).

  • A - absorbance
  • T - transmitance
  • ε - molární absorpční (extinkční) koeficient
  • l - délka kyvety
  • c – koncentrace

Absorbance závisí na molárním extinkčním koeficientu (pro jednu látku je vždy konstatní) na délce paprsku při které dochází k absorpci (v praxi kyveta – konstantní) a na koncentraci. Jelikož ze tří veličin jsou dvě konstantní, absorbance závisí na koncentraci. Můžeme tedy vytvořit graf závislost absorbance na koncentraci, ve kterém osa x bude představovat koncentrace, a osa y absorbanci.

Absorbční křivka

Jak jste se již mohli dočíst v části barevnost látek, závisí barevnost látky na absorpční křivce v oblasti viditelného záření. Charakter absorpční křivky u sloučenin je pásový a projevuje se vznikem absorpčního pásu zvaného peak (čti: pík). Vlnová délka nejvyšší hodnoty peaku se označuje jako λmax. Pokud se vlnová délka λmax nepřekrývá s absorpčními pásy dalších součástí měřeného vzorku, je λmax nejvhodnější vlnová délka pro stanovení koncentrace.

Vztažná kapalina (slepý vzorek)

Slepý vzorek se používá pro nastavení nulové hodnoty absorbance. Tento vzorek musí obsahovat veškeré části jako vzorek měřený, avšak bez měřené látky. Kyveta část světla odráží, a látky obsažené v měřených vzorcích mohou též část světla absorbovat či rozptylovat.

Rozdělení fotometrických metod

Spektrofotometrie

Nejběžnější typ přístroje pro fotometrická měření je Spektrofotometr . Zdrojem světla bývá halogenová žárovka, která vydává spojité spektrum. Světlo je usměrněno na mřížku nebo hranol, kde dojde k rozkladu spektra. Další štěrbinou je vybrána úzká část spektra, která prochází kyvetou se vzorkem a dopadá na fotonku, diodu či fotonásobič, který slouží jako senzor. Energie ze senzoru je pak převedena do odpovídající číselné hodnoty, nejčastěji Absorbance nebo Transmitance.

Kolorimetrie

Kolorimetr je levná varianta spektrofotometru. V kolorimetru nedochází k rozkladu světla na mřížce, ale do paprsku jsou zařazeny filtry: červený, zelený či modrý. Některé kolorimetry měří ve vybraných vlnových délkách, daných zdrojem světla, jímž jsou LED diody příslušných barev (nejčastěji červená, žlutá, zelená a modrá).

AAS - atomová absorpční spektroskopie

Metoda AAS je určená pro měření koncentrace mnoha prvků, nejčastěji kovů. Látka je před vlastním měřením dokonale převedena do roztoku (mineralizována). Tento roztok je pak v přesných dávkách vstřikován do plamene. Prvky jsou excitovány v plameni a díky absorpčním vlastnostem zachytávají světlo vybraných vlnových délek. Zdrojem světla je výbojka obsahující kov, který je právě stanovován. Taková výbojka vydává světlo o vlnových délkách odpovídajícím absorbovaným vlnovým délkám. Pokles intenzity tohoto světla závisí na koncentraci prvku v měřeném roztoku, podle Lambert Beerova zákona. Kyvetou je plamen.

Fluorimetrie

Fluorimetrie využívá fluorescence látek. Princip je takový, že fluoreskující látka po ozáření světlem o krátkých vlnových délkách (nejčastěji UV), vydává sekundární záření o nižší energii. Přístoj měří intenzitu sekundárního záření.

Zákalové metody

Pro měření koncentrace koloidních roztoků se využívají dvě metody. Průchodem světla koloidním roztokem dochází k jeho rozptylu. Část světla roztokem projde v původním směru, část se rozptýlí do stran. Turbidimetrie využívá měření intenzity světla, které prochází v původním směru. Nefelometrie využívá měření intenzity rozptýleného světla.

Metody určení koncentrace

Výpočet z Lambert-Beerova zákona

Hodnoty Koncentrace lze určit dosazením do Lambert-Beerova zákona, pomocí molárního absorpčního koeficientu.  Metoda je vhodná pouze v některých prověřených postupech, u nichž je molární absorbční koeficient dobře znám a výsledky jsou spolehlivé.

Metoda jednoho standardu

Metoda využívaná v rutinním provozu u prověřených postupů.
Jedná se v podstatě o sestrojení kalibrační křivky pomocí jednoho standardu a slepého vzorku. Koncentrace standardu se nachází uprostřed referenčního rozmezí hodnot, nebo v oblasti s nejčetnějším výskytem naměřených hodnot.
Používá se u spolehlivých analytických metod, kde byla opakovaně ověřena lineární závislost absorbance na koncentraci.

Sestrojení kalibrační křivky

Postup: Připravíme si řadu roztoků o známé koncentraci. Koncentrace těchto roztoků by měla přibližně pokrývat oblast koncentrací, u nichž bude absorbance při vlnové délce  λmax v intervalu 0,000-1,000. Pro jednotlivé roztoky naměříme absorbanci a sestrojíme graf. Na osu x vyneseme koncentrace, na osu y naměřené absorbance. Body propojíme a získáme Kalibrační křivka. Pokud body neleží na spojnici, využijeme pro zpracování lineární regresi. (viz kapitola: Vyhodnocování laboratorních výsledků, Grafy)

Odečítání výsledků: Do grafu na osu y vyneseme naměřenou hodnotu absorbance, vodorovně vyneseme přímku protínající kalibrační křivku. Ve svislém směru z oxy x odečteme koncentraci.

Přístroj na měření absorbance

Přístroj na měření absorbance – Spekol 11

Základní části přístroje Spekol 11

Obsluha:

  • Uvedení do provozu. Po pohledové kontrole (viz kapitola BOZP) Přístroj zapojíme do elektrické sítě a zapneme spínačem umístěným na čelní desce vpravo dole (1).
  • Nastavení režimu. Na ovládacím panelu přepneme do režimu měření absorbance - tlačítko označené písmenem E (2). Na displeji se zobrazí číselná hodnota. Tlačítkem označeným R(3) tuto hodnotu vynulujeme. V prvních minutách se hodnota na displeji mění, tak jak z počátku kolísá výkon halogenového zdroje. Po několika minutách se přístroj ustálí a zobrazovaná hodnota se již výrazně nemění.
  • Nastavení vlnové délky. 1) Vlnová délka se na přístroji nastavuje pomocí šroubu umístěného vpravo od kyvetového prostoru. Na nerotující části šroubu odečítáme celé stovky, na rotující části nastavujeme desítky a jednotky nm.  
  • Při vlnových délkách nad 620 nm je třeba vyměnit fotonku, což se provede vytažením táhla na detektoru ve směru červené šipky. Při vlnových délkách kratších než 620 nm se táhlo na detektoru zatlačí ve směru modré šipky.
  • Vkládání kyvety. Kyvety mají 2 lesklé a 2 matné plochy. Kyvet se dotýkáme pouze na matných plochách. Lesklé plochy musí být zcela čisté. Kyvety pro měření vybíráme i podle tloušťky, která je vyrytá u horního okraje kyvety.
  • Kyvetu naplníme slepým vzorkem a vložíme do kyvetového prostoru. Lesklé ploch kyvety musí být ve směru paprsku. Kyvetu zasuneme a pomocí tlačítka R nastavíme hodnotu absorbance 0,000. Do druhé části kyvetového prostoru vložíme kyvetu se vzorkem, kyvetu zasuneme a na displeji přečteme hodnotu absorbance. Kyvetu s měřeným vzorkem pak lze libovolně měnit za jiný vzorek. Kyveta se slepým vzorkem slouží ke kontrole nastavení A=0,000.
 
Media