Separační metody v analytické chemii - chromatografie

Separační metody

Základním úkolem separačních metod je rozdělení směsí látek. Dělit směsi lze na základě rozdílných fází, rozdílných fyzikálních vlastností látek, ve směsích obsažených.


 tabulka
 

V preparativní chemii jsme poznali filtraci, krystalizaci, sublimaci, destilaci, destilaci s vodní parou, extrakci, sedimentaci apod. Tyto metody lze též využít v analýze léčiv, v přípravě vzorků či v gravimetrických stanoveních. Nejrozšířenější moderní separační metodou v analytické chemii je však chromatografie. V dnešní analytické chemii a tedy i analýze léčiv se využívá řada chromatografických metod. Základním pojmem je chromatogram.
Chromatografické metody jsou využívány v analytické chemii pro kontrolu totožnosti látky, pro kontrolu čistoty a pro analýzy směsí.

Vstupní předpoklady

•    Slabé vazebné interakce
•    Příprava směsí, roztoků
•    výpočet a měření objemu
•    Práce se sklem – příprava kapiláry
•    Nanášení malého množství vzorku kapilárou


Princip chromatografie


Principem metody je rozdílná rychlost pohybu látek v soustavě mobilní a stacionární fáze. Vzorek, který obsahuje několik složek je unášen mobilní fází. Podle toho, jak jsou jednotlivé složky poutány k stacionární a mobilní fázi dochází k tomu, že některé složky se pohybují rychleji a jiné pomaleji.
•   
Chromatografie 3 látek a jejich směsi

Výstupem metody chromatografie je chromatogram. Z chromatogramu lze pro každou látku určit buď retardační faktor, nebo retenční čas. Na obrázku je znázorněn chromatogram 3 různých látek A, B, C a jejich směs. Látky se vzájemně odlišují retardačním faktorem, tzn. zpožděním oproti čelu mobilní fáze.

Základní pojmy


•    Stacionární fáze – porézní materiál, nejčastěji silikagel, oxid hlinitý, celulóza apod. V průběhu analýzy se částice stacionární fáze nepohybují.
•    Mobilní fáze – kapalina nebo plyn (u plynové chromatografie). V průběhu metody se částice pohybují po stacionární fázi.
•    Retenční čas - Při průběhu se mobilní fáze pohybuje po stacionární a při tom s sebou nese rozpuštěné látky. Pohyb látek je oproti mobilní fázi zpožděn. Toto zpoždění se nazývá retenční čas.
•    Retardační faktor - Poměr vzdálenosti, kterou urazila látka oproti vzdálenosti, kterou urazilo čelo mobilní fáze. Maximální hodnota retardačního faktoru je 1.
•    Vzorek – analyzovaná látka či směs. Pro správné nanesení vzorku je nutné jej rozpustit ve vhodném rozpouštědle. Jako rozpouštědlo může být použita i mobilní fáze.
•    Interakce – slabé vazby mezi molekulami, např. vodíková vazba, van der Waalsovy síly, lipofilní, hydrofilní síly apod.
•    Chomatografická komora – nádoba, v níž probíhá chromatografie s plošným uspořádáním.

Fyzikálně-chemické principy dělení

Rozdělení metod podle typu intrakcí
•    Adsorpční chromatografie – stacionární fáze je sorbent
•    Rozdělovací chromatografie – stacionární fází je zakotvená kapalina
•    Gelová chromatografie - stacionární fází jsou zrnka gelu
•    Iontově výměnná chromatografie - stacionární fází je iontoměnič
•    Afinitní chromatografie - stacionární fází je zakotvená liganda s vysokou afinitou k jednomu typu molekul.

Adsorpční chromatografie

Adsorpce je proces, při kterém se látka interaguje s absorbentem. Možnosti adsorpce jsou fyzikální i chemické. Původ sil v chromatografických procesech je především v interakcích ion-ion, dipól-dipól, ion-dipól, interakcí indukovaných dipólů, vodíkových můstků a hydrofobních sil.
Stacionární fází je sorbent. Sorbent je látka, která ke své hmotnosti má obrovský povrch na němž obsahuje skupiny, které tvoří slabé vazby s rozpuštěnými látkami. Tyto slabé vazby zadržují molekuly látek, které jsou rozpuštěny (vypařeny) v mobilní fázi. Nejběžnějšími sorbenty používanými v chromatografii jsou Silkagel, oxid hlinitý a křemelina. Povrch těchto látek obsahuje polární skupiny schopné interakce s různými skupinami.

Rozdělovací chromatografie

Při rozdělovací chromatografii dochází k dělení látek na základě rozdílných rozdělovacích koeficientů. Rozdělovací koeficient udává poměr rozpustnosti látky mezi dvěma kapalinami. Stacionární fází je kapalina odlišná od mobilní fáze (plyn, kapalina). Touto kapalinou bývá pokryt povrch sorbentu. K dělení látky při rozdělovací chromatografii dochází díky rozpouštění látky ve stacionární fázi.
Podmínkou pro úspěšné dělení je vyšší rozpustnost látky ve stacionární fázi, než ve fázi mobilní. Tímto způsobem lze připravit stacionární fáze:

•    Vodné
•    polární
•    nepolární

Chromatografický papír, či tenká vrstva se připravuje rozpuštěním stacionární fáze (např. DMF, etylenglykol, 1-oktanol apod.) v těkavém rozpouštědle. Roztok se nanese na papír (tenkou vrstvu) a rozpouštědlo se nechá odpařit. Sorbent je schopen pojmout asi 20% své hmotnosti jinou kapalinu. Papír často obsahuje několik % vody.

Gelová chromatografie

V anglické literatuře se tento typ chromatografie nazývá size-exclusion chromatography, což znamená velikostně-vylučovací chromatografie. Stacionární fází jsou Hrudky gelu, který pojímá malé molekuly, čímž způsobují jejich retardaci. Fungují jako molekulární síto pro molekuly do určité velikosti.  Velké molekuly (např. proteiny) tyto hrudky gelu obtékají kolem. Metoda se využívá především u dělení makromolekulárních látek, proteinů, enzymů, polysacharidů apod.
Hrudky gelu jsou polysacharidy dextriny, zesíťované epichlorhydrinem, nazývané sephadexy. Tyto útvary obsahují dutiny schopné pojmout molekuly menších rozměrů a vhodných tvarů. Malé molekuly pronikají hluboko do gelu, což způsobuje jejich retardaci.

Iontově výměnná chromatografie

Iontoměnič Ionex je polymerní látka, která na svém povrchu obsahuje skupiny schopné disociace v roztoku. V roztoku se z ionexu uvolňují ionty a ionex se sám stává iontem, který se však díky obří molekule nerozpustí. Aktivní povrch ionexu pak interaguje s dalšími ionty v roztoku. Ionty se liší afinitou k iontoměniči. Při pohybu mobilní fáze obsahující ionty pak dochází k zadržování některých iontů a následně pak k postupnému vymývání. Iontoměnič lze regenerovat, jakmile je dostatečná koncentrace iontů, které původně obsahoval.

Použití iontoměničů má velký význam i v technologických postupech, například úpravě vody. Demivoda (demineralizovaná voda) se připravuje použitím kyselých katexů a zásaditých anexů. Katexy zamění kationy za H+, anexy zamění aniony za OH-. Takto se získává kvalitní demivoda do průmyslových provozů i malých laboratoří. Příkladem využití ionexů v domácnosti na nádobí.  Aby toto zařízení dobře fungovalo, potřebuje měkkou vodu. Přítok obsahuje katex, na které probíhá výměna Ca2+ iontů z vody, za ionty Na+. Po každém použití se katex regeneruje regenerační solí  - chloridem sodným.

Katex – iontoměnič reagující s kationy. Tyto iontoměniče obsahují nejčastěji kyselé skupiny – SO3H nebo -COOH. Sulfonová skupina se chová jako silný katex, karboxylová skupina jako slabý katex. Běžně se používají kopolymery styrenu s podílem 4-ethenylbenzensulfonové kyseliny.
Anex – iontoměnič obsahující zásadotvorné skupiny, jako jsou kvartérní amonné ionty. Jako anexy se opět používají kopolymery se styrenem.

Ukázka struktury ionexu

Regenerace iontoměřiče: Ionexy lze regenerovat za použití roztoků obsahujících původní ionty. Jako regenerační roztoky leze použít kyseliny, zásady, nebo i NaCl, záleží na konkrétním použití a ionexu.

Afinitní separace

Jedná se o metody určené pro separaci bioaktivních látek. Metoda se častěji využívá jako selektivní separace, než jako chromatografie. Metody jsou založeny na specifických sorpcích, charakteristických pro biologické procesy:
•    enzym – inhibitor
•    protilátka – antigen
•    receptor - hormon 
Princip Afinitní separace: stacionární fáze  je vhodný nosič (např. agarosa) obsahující jednu látku z uvedených dvojic. Po přidání roztoku s obsahem aktivního protipólu dochází k selektivní sorpci těchto látek na povrch nosiče.
Změnou mobilní fáze dojde se látka eluuje – uvolňuje z povrchu sorbentu. Afinitní separací lze zakoncentrovat látky obsažené ve velmi malých koncentracích. Takto připravený koncentrát lze využít pro další analýzu.

Uspořádání chromatografických metod

Hlavní dva typy uspořádání jsou sloupcové a plošné

Podle způsobu provedení rozlišujeme tyto metody:

•    Papírová chromatografie
•    Tenkovrstvá chromatografie TLC
•    Sypaná vrstva
•    Sloupcová chromatografie
•    Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC
•    Plynová chromatografie GC

Plošné uspořádání

Plošné uspořádání: Papír, sypaná vrstva, tenká vrstva. U plošného uspořádání je pohyb mobilní fáze způsoben nejčastěji vzlínáním mobilní fáze. Výhodou takového uspořádání je dostupnost, jednoduchost provedení i snadné hodnocení výsledného chromatogramu. Nevýhody plošného uspořádání jsou především v nemožnosti využití pro kvantitativní stanovení, někdy i dlouhá doba analýzy. Některé mobilní fáze (zvláště protické – voda, alkoholy, kyselina octová apod.) vzlínají velmi pomalu.

Papírová chromatografie

Stacionární fází je chromatografický papír. Papír je vrstva celulózních vláken, které často obsahují několik % vody. Start se označuje tužkou, uspořádat chromatografickou soustavu lze vzestupně, sestupně, hvězdicově.

TLC chromatografie

TLC, dnes nejběžnější plošně uspořádaná chromatografie.TLC znamená Thin Layer Chromatography, česky: tenkovrstvá chromatografie. Jedná se o tenkou vrstvu sorbentu přichyceného na podložku z hliníku, skla či polymeru. Nejběžnějším sorbentem je silikagel. K některým vrstvám výrobci přidávají lumifor, světélkující v UV spektru, nejčastěji při 254nm, nebo 366nm, sloužící vyhodnocování chromatogramu.
K TLC chromatografii je potřebná i chromatografická komora, nádoba ve které probíhá vzlínání mobilní fáze. Pro zdárný průběh chromatografie je nutné, aby se chromatografické komoře nasytily páry mobilní fáze. Do komory se tedy vkládá i arch filtračního papíru, sloužící k urychlení odparu mobilní fáze.

Provedení TLC chromatografie
Z archu ustřihneme nůžkami odpovídající část tenké vrstvy a obyčejnou tužkou naznačíme start (čáru ve výšce asi 1,5-2 cm od spodního okraje) S tužkou pracujeme tak, abychom neporušili vrstvu sorbentu. Na start budeme vynášet zkoumané vzorky a standardy. Tužkou označíme místa, kam naneseme vzorky. Vzorky nanášíme rozpuštěné v těkavém rozpouštědle, nebo v mobilní fázi, kterou budeme používat.
Do chromatografické komory nalijeme mobilní fázi 0,5-1cm ode dna a vložíme ústřižek filtračního papíru, aby se zvýšila plocha odparu. Po nasycení par (odhadem po několika minutách) vložíme tenkou vrstvu do chromatografické komory a komoru uzavřeme. Sledujeme pohyb mobilní fáze. Až dosáhne mobilní fáze dostatečnou výšku, obvykle asi 1-2 cm od horního okraje tenké vrstvy, vyjmeme chromatogram a tužkou označíme, kam až dosáhla mobilní fáze.


Hodnocení chromatogramu:
Barevné látky vidíme a můžeme odhadem určit těžiště skvrny.  Pokud porovnáváme látky podle standardu, musí se tyto látky nacházet ve stejné vzdálenosti od startu, jako standard.
Určení Rf – retardačního faktoru. Změříme vzdálenost, jakou dosáhlo čelo mobilní fáze od startu. Změříme vzdálenost hodnocené skvrny od startu. Poměr vzdáleností start-skvrna a start-čelo je retardační faktor Rf.
Nebarevné látky.
Zobrazení nebarevných látek je možné několika způsoby.
1) látka absorbující UV záření- (aromáty). Použijeme TLC vrstvu s lumiforem. Chromatogram se hodnotí pod UV lampou, nejčastěji 254nm. Látka překrývá lumifor, který pak není ozářen UV zářením a skrvna se zviditelní jako místo, které nefluoreskuje.
2) látka neabsorbuje UV – je třeba najít činidlo, které s látkou vytvoří barevnou sraženinu nebo komplex a zviditelní tak skvrnu. Takovým činidlem postříkáme tenkou vrstvu pomocí fixírky, nebo mechanického rozprašovače. Některé látky můžeme zviditelnit i pomocí reaktivních plynů – např. oxidů dusíku či amoniaku.  Takovou detekci provádíme zásadně v digestoři.

Sypaná vrstva

Sypaná vrstva je podobné uspořádání jako u TLC, vrstva sorbentu však bývá mnohem silnější až několik mm. Metoda nachází uplatnění především v preparativní chemii k separaci obtížně separovatelných látek.
Sypaná vrstva se připravuje nasypáním vrstvy sorbentu na skleněnou podložku. Vrstva se zarovná pomocí skleněné tyčky opatřené na koncích vymezovacími kroužky. Takto zajistíme stejnoměrnou výšku vrstvy. Na vrstvu nelze zapisovat tužkou. Vzorek se nanáší rozpuštěný injekční stříkačkou, nebo i pipetou. Do komory se vkládá opatrně tak, aby se vrstva nenarušila. Hladina mobilní fáze musí níž než nanesený vzorek. Podložka musí mít mírný sklon. Chromatografii ukončíme, až mobilní fáze dosáhne dostatečné výšky.
Kombinace s elektroforézou
Chromatografie probíhá na podložce vložené do elektrického pole. Pohyb látek probíhá dvěma směry. Jeden směr je dán pohybem látky díky mobilní fázi, v kolmém směru k tomuto pohybu probíhá pohyb v elektrickém poli. Této metody se využívá především při analýze proteinů.

Sloupcové uspořádání

Sloupcové uspořádání má značné možnosti dalšího využití a urychlení procesu separace. dělení probíhá v trubici naplněné sorbentem. Takovou trubici nazýváme sloupec nebo kolona.

Sloupcová chromatografie

 Základem sloupcové chromatografie je kolona, tvořená trubicí, ve spodu opatřenou fritou a kohoutem. Do trubice se připraví suspenze sorbentu, který vytvoří sloupec. Rozdělovanou směs nalijeme do trubice a necháme vytékat mobilní fázi, kterou průběžně zachytáváme do zkumavek nebo vialek po určitém objemu (např 5ml). V průběhu chromatografie doléváme mobilní fázi do trubice. Sloupec nesmí vyschnout, jinak se v něm objeví trhliny a nedojde k rozdělení.
Detekce: látky barevné dokážeme zachytit do zkumavek, když vidíme, že začínají vytékat z kolony. Při chromatografii nebarevných látek musíme plnit jednotlivé zkumavky (vialky) a v nich poté provést detekci jiným způsobem. Např. fotometricky, konduktometricky, potenciometricky, fluorescentně, pomocí srážecích akcí s činidlem či pomocí tvorby barevných komplexů. Vždy záleží na konkrétní látce a jejích vlastnostech.
Dělení na sloupci lze urychlit zvýšeným tlakem na hladinu mobilní fáze.

HPLC chromatografie

HPLC Vysokoúčinná kapalinová chromatografie, nebo vysokotlaká kapalinová chromatografie. Základem je čerpadlo s vysokým tlakem mobilní fáze, vysoce účinná kolona a detektor.
Čerpadlo tlačí pod tlakem až 30MPa  (300x vyšší než tlak atmosférický) mobilní fázi do kolony. Zde dojde k rozdělení vzorku a jednotlivé části pak postupně protékají detektorem. Detektor měří jak koncentraci protékající látky, tak čas uplynulý od chvíle startu. Používaných detektorů je celá řada. Nejběžnějším detektorem je UV-VIS spektrofotometr. Často je k němu připojen i fluorimetr, dále se používá například konduktometr. Jednotlivé detektory lze řadit za sebou a sledovat různé látky.
Chromatogram pak ukazuje závislost odezvy detektoru na čase analýzy. Jednotlivé složky se ukazují jako peaky, jejich koncentrace je zobrazena jako plocha pod peakem. V dnešní době zabezpečuje vyhodnocování a výpočty počítač.

GC chromatografie

GC Plynová chromatografie – Gas chromatography.
Plynová chromatografie je metoda, kde mobilní fází je plyn, nejčastěji helium, dusík nebo vodík. Zkoumané látky se musí dát vypařit a b v tomto stavu stabilní. Plynový chromatograf je zařízní do kterého proudí plyn, který unáší látku kolonou. Kolona je uložena v prostoru, ve kterém je možné nastavovat teplotu a řídit tak průběh analýzy. Kolony se liší obsahem, buď se používají kolony sypané (se sorbentem), nebo kapilární (velmi dlouhá stočená kapilára).
Nejpoužívanějším detektorem je FID. V tomto detektoru vstupuje analyzovaný vzorek do plamene. V plameni hoří směs vodík – vzduch. Pokud do plamene vstoupí uhlíkaté látky, vzroste jeho vodivost. FID detektor měří vodivost plamene.
Chromatogram ukazuje závislost vodivosti (odezvy detektoru) na čase. Rozdělené látky vstupují do plamene v různém čase a na chromatogramu je vidíme jako peaky. Koncentrace látky je zobrazena jako plocha pod peakem. Dnešní přístroje používají k ovládání, zobrazování a výpočtům počítač.

 
Media