Refraktometrie

Refraktometrie je metoda, která je založena na zjišťování indexu lomu látek.

Vstupními předpoklady pro tuto kapitolu jsou:

• lom světla (od kolmice, ke kolmici)
• kolmice dopadu, úhel dopadu a úhel lomu
• totální odraz, mezní úhel lomu a mezní úhel dopadu
• klouzavý paprsek, optická prostředí

Dopadá-li světelný paprsek na rozhraní dvou prostředí, mohou nastat dva krajní případy. Světelný paprsek se na rozhraní prvního prostředí odrazí a do druhého prostředí nepronikne. Druhou možností je, že paprsek projde z prvního prostředí do druhého, přičemž ve druhém prostředí dojde ke změně rychlosti šíření paprsku a směru jeho šíření – nastane Lom světla.

Pokud je první prostředí opticky hustší než druhé prostředí, dochází k lomu od kolmice (voda-vzduch, sklo-vzduch). Je-li první prostředí opticky řidší než druhé prostředí, nastává lom ke kolmici (vzduch-voda,vzduch-diamant).

Index lomu

Index lomu světla je konstanta, definovaná jako poměr rychlosti světla v prvním a druhém prostředí.

Index lomu může být absolutní (značí se N) nebo relativní (značí se n). Definiční vztahy jsou:

N = c/v

kde c je rychlost šíření světla ve vakuu (c=300 000 km/s) a v symbolizuje rychlost šíření světla v daném prostředí. Označení N_sklo nebo N_diamant se pak čte jako absolutní index lomu skla, resp. absolutní index lomu diamantu.

Absolutní index lomu světla je číslo bezrozměrné, vždy větší než 1 (rychlost světla ve vakuu je největší dosažitelnou rychlostí).

n_1,2 = v₁/v₂

kde v₁ značí rychlost šíření světla v prvním prostředí a v₂ rychlost šíření světla v druhém prostředí. Označení n_voda,sklo pak symbolizuje relativní index lomu světla při průchodu světla z vody do skla.

Jestliže prvním prostředím je vzduch, má relativní index lomu prakticky stejnou hodnotu jako absolutní index lomu druhého prostředí, protože rychlost světla ve vzduchu se jen nepatrně liší od rychlosti světla ve vakuu. V praxi se proto často uvádí n_sklo a vynechává se označení prvního prostředí, kterým je vzduch.

Vzhledem k tomu, že rychlost světla se obtížně měří, využívá se často k definici indexu lomu toho, že paprsek ve druhém prostředí mění nejen rychlost, ale i směr šíření. Pak je index lomu možné zapsat rovnicí:

N = v₁/v₂ = sin α /sinß

α je úhel dopadu (úhel, který svírá dopadající paprsek s kolmicí dopadu) a β je úhel lomu (úhel, který svírá lomený paprsek s kolmicí dopadu).

Jestliže paprsek dopadá na rozhraní obou prostředí pod úhlem 90°, láme se ve druhém prostředí pod úhlem, který je označován jako mezní (maximální) úhel lomu γ. Tento úhel představuje maximální prostor, do kterého se ve druhém prostředí světelný paprsek může dostat, a vytváří tak rozhraní světla a stínu.

Tento úhel je pro měření indexu lomu velmi důležitý. Jestliže se měřicí přístroj nastaví tak, aby paprsek dopadal rovnoběžně s rozhraním prostředí, je index lomu roven převrácené hodnotě sinu úhlu γ (sin 90°=1).

n = sin 90°/sin γ = 1/sinγ

Hodnotu indexu lomu mohou ovlivňovat některé faktory:

• Vlnová délka použitého světla (nejvíce se láme světlo fialové barvy a má tedy nejmenší úhel lomu) – aby bylo možné porovnávat hodnoty indexu lomu, používá se standardní vlnová délka 589 nm. Je to vlnová délka žlutého sodíkového světla, při které je v emisním spektru sodíku žlutá čára označovaná jako čára D. Proto se v tabulkách nebo v platném lékopise index lomu označuje n_D. To znamená, že měření bylo provedeno při vlnové délce 589 nm.
  Při použití bílého světla dochází k rozložení světla (Disperze světla) na jednotlivé barevné složky. To se projeví jako barevné spektrum v zorném poli. Disperze světla se odstraní použitím kompenzačního hranolu.
• Teplota – závislost indexu lomu na teplotě je velmi významná, index lomu klesá se stoupající teplotou. Je proto nutné během měření udržovat předepsanou teplotu s přesností ±0,2 °C. Teplota, při které se index lomu měřil, se uvádí jako horní index n²⁰. To znamená, že měření bylo provedeno při teplotě 20 °C.
• Druh látky – index lomu je pro danou látku charakteristický. Hodnoty indexu lomu látek jsou uvedeny v tabulkách nebo v lékopisu a mohou být porovnávány s naměřenými hodnotami (pokud se dodrží výše uvedené faktory). Toho se využívá např. při zkouškách totožnosti.
  Naměřené hodnoty indexu lomu mohou též posloužit k potvrzení nebo určení struktury látky. K tomu se využívá veličina zvaná molární refrakce R_M (viz dále).
• Přítomné nečistoty v látce – uvedeno v některých lékopisných článkách ve zkouškách na čistotu.
• Koncentrace látky v roztoku – z hlediska analýzy léčiv se jedná o velmi důležitý faktor, protože umožňuje na základě indexu lomu roztoku určit koncentraci látky v tomto roztoku. K tomu se využívá tzv. kalibrační křivky. Je však nutné mít na paměti, že závislost indexu lomu roztoků není v celém koncentračním rozmezí lineární, a proto se pro zhotovení kalibrační křivky využívá vždy jen úzké koncentrační rozmezí, kde je možné linearitu předpokládat (kalibrační křivka viz dále).

Molární refrakce

Molární refrakce se značí R_M a lze ji použít k ověření struktury látky. Tato konstanta se může spočítat dvěma způsoby:

1. na základě naměřených hodnot (hustota, index lomu), podle vzorce R_M = M/ρ . (n²-1)/(n²+2)
   M značí molární hmotnost látky (g/mol), ρ hustotu látky (g/cm³) a n index lomu látky
2. Na základě tabulkových údajů tzv. atomových refrakcí R_A. Součtem všech příspěvků atomových refrakcí do molekuly se získá celková molární refrakce.

Pro potvrzení struktury látek je nutné porovnat molární refrakci spočítanou oběma způsoby, a pokud nastane shoda, je možné považovat strukturu látky za potvrzenou.

Využití molární refrakce je nejlépe demonstrováno na následujícím příkladu:

Látka, jejíž molekulový vzorec je C₃H₆O, má při 20 °C hustotu = 0,8006 g/cm³ a index lomu 1,3641. Rozhodněte, zda má tato látka vzorec CH₂=CH—CH₂—OH nebo CH₃—CO—CH₃.

Postup řešení:

Spočítá se hodnota z uvedených údajů hustoty a indexu lomu. Molární hmotnost obou navržených struktur činí 58 g/mol. Výsledek výpočtu R_M je 16,152 cm³/mol.

V tabulkách se vyhledají hodnoty atomových refrakcí, kterými přispívají jednotlivé složky do celkové hodnoty molární refrakce:

• R_A(C) = 2,418 cm³/mol
• R_A(H) = 1,100 cm³/mol
• R_A(=O) = 2,210 cm³/mol (kyslík s dvojnou vazbou)
• R_A(O) = 1,525 cm³/mol (ve skupině OH)
• R_A(dvojné vazby) = 1,733 cm³/mol 

Vypočítá se hodnota molární refrakce pro obě uvažované látky:

• prop-2-en-1-ol: R_M = 3*2,418 + 6*1,100 + 1,525 + 1,733 = 17,112 cm³/mol
• aceton: R_M = 3*2,418+6*1,100 + 2,210 = 16,064 cm³/mol

Z porovnání molárních refrakcí je vidět, že z obou navržených struktur dosahuje lepší shody molární refrakce struktura acetonu CH₃—CO—CH₃.

Stanovení koncentrace roztoku metodou kalibrační křivky

Pokud je potřeba stanovit koncentraci roztoku refraktometricky, používá se (hlavně u rutinních měření) tzv. kalibrační křivky.

Kalibrační křivka se vytvoří tak, že se změří indexy lomu kalibračních roztoků a zanesou se do grafu proti koncentraci těchto roztoků. Koncentrace roztoku je nezávisle proměnná, a proto se znázorňuje na ose x, index lomu je závisle proměnná (závisí na koncentraci) a zaznamenává se na osu y. Pokud koncentrační rozmezí měřených kalibračních roztoků není příliš velké, je možné předpokládat, že čára spojující jednotlivé body bude mít lineární průběh. K sestrojení kalibrační křivky se s výhodou využije např. tabulkový procesor Microsoft Excel, jak je uvedeno v kapitole Vyhodnocování laboratorních výsledků.

Kalibrační roztoky jsou roztoky, které obsahují stejnou látku jako měřený roztok. Připravují se v takových koncentracích, aby předpokládaná koncentrace vzorku byla přibližně ve středu zvoleného koncentračního intervalu. Těchto roztoků se obvykle připravuje lichý počet (nejčastěji 5). Kalibrační křivka (resp. přímka) neprochází počátkem, protože index lomu žádného rozpouštědla není nulový.

Při stanovení koncentrace roztoku vzorku se změří index lomu tohoto roztoku a z kalibračního grafu se pak odečte koncentrace odpovídající naměřenému indexu lomu. Koncentraci je možné vypočítat také z rovnice regrese (viz kapitola Vyhodnocování laboratorních výsledků).

Refraktometry

Přístroje na měření indexu lomu se nazývají refraktometry. Nejčastěji se používají dva typy přístrojů – ponorný refraktometr (lomný hranol a dalekohled zaujímají vzájemně stálou polohu) a suchý refraktometr (lomný hranol a dalekohled přístroje jsou pohyblivé).

Ponorný refraktometr má jako hlavní součást šikmo seříznutý lomný hranol, který se ponořuje do měřené kapaliny. Podle druhu měřené kapaliny se používá hranol, jehož rozsah umožňuje měření indexu lomu daného roztoku. Světelný paprsek prochází hranolem do tubusu dalekohledu, ve kterém je umístěna optická soustava čoček, soustřeďujících svazek paprsků do jednoho místa na stupnici, kterou pozorujeme okulárem na konci tubusu. Index lomu se odečítá na stupnici v místě, které ukazuje rozhraní světla a stínu. Ponorný refraktometr

Ponorný refraktometr se využívá k rychlému měření indexu lomu např. v lihovarech nebo cukrovarech. Pro analytické účely se příliš nehodí, neboť vyžaduje značné množství měřeného roztoku.

V současné době se používají tzv. ruční refraktometry, které vzhledem velmi připomínají ponorný refraktometr, avšak není nutné celý hranol ponořit do roztoku –měřená kapalina se na hranol kápne. Tento refraktometr používají např. včelaři, kteří podle indexu lomu určují obsah vody v medu.

Abbeův Refraktometr má jako hlavní součást dva šikmo seříznuté hranoly. Jeden z nich se označuje jako osvětlovací – je drsný a jeho úkolem je rozptýlit světlo do všech směrů. Druhý hranol je nazýván měřící (lámavý) – má hladkou plošku. Nanášení vzorkuZkoumaná kapalina se kápne na měřící hranol, který je sklopen do vodorovné polohy. K měřícímu hranolu se přitiskne hranol osvětlovací a měřená kapalina vytvoří mezi oběma hranoly tenkou souvislou vrstvu. Hranoly mohou být vytápěny kapalným médiem, aby se dosáhlo předepsané teploty. Svazek paprsků bílého světla vstupuje pomocí odrazového zrcátka do hranolů, mezi kterými je měřená kapalina, a postupuje dále do dalekohledu, v jehož tubusu je uložen kompenzátor disperze světla. Šroub spojený s otočnými hranoly umožní nastavit v zorném poli ostré rozhraní světla a stínu do středu nitkového kříže. V lupě, která je zaostřena na stupnici, se odečítá index lomu s přesností na 3 desetinná místa. Čtvrté desetinné místo se odhaduje podle polohy ukazatele mezi dvěma nejmenšími dílky stupnice. Abbeův refraktometr

Hranoly se po skončeném měření omyjí destilovanou vodou a opatrně otřou měkkým hadříkem, aby nedošlo k jejich poškrábání. Pokud se pracuje se silicemi, je povoleno k čištění hranolů použít vhodné organické rozpouštědlo.

Měření indexu lomu je nutné několikrát opakovat a z naměřených hodnot vypočítat aritmetický průměr. Při výpočtu aritmetického průměru je někdy nutné vyřadit hodnoty, které evidentně vybočují z řady výsledků. K tomu, aby se posoudilo, jestli se má daná hodnota vyřadit, je možné využít Dixonův parametrický test odlehlých hodnot nebo jinou podobnou metodu (viz sbírka příkladů).

Využití metody

Refraktometrie je metoda, kterou je možné využít ve farmacii ke zkouškám totožnosti a ke zkouškám na čistotu. Jako příklad využití metody je možné uvést např. lékopisné články Glycerolum, Methanolum, Anisi etheroleum, Carvi etheroleum, Eucalypti etheroleum a další silice, Ricini oleum raffinatum, Helianthi oleum raffinatum.